应用化学综合实验报告
——明矾的制备及其单晶培养
——酪氨酸酶的提取及催化活性的研究
031102班_____
实验一明矾的制备及其单晶培养
一、明矾的基本性质与用途
明矾，学名为十二水合硫酸铝钾，又称明矾、白矾、钾矾、钾铝矾、钾明矾，是含有结晶水的硫酸钾和硫酸铝的复盐。其分子式是KAl(SO4)212H2O，加合式是K2SO4Al2(SO4)324H2O，相对分子质量为474.39，无色立方，单斜或六方晶体，有玻璃光泽，密度为1.757g/cm3，熔点92.5℃。在.5℃时失去9个分子结晶水，200℃时失去12个分子结晶水，溶于水，不溶于乙醇。
明矾性味酸涩，寒，有毒。故有抗菌作用、收敛作用等，可用做中药。明矾还可用于制备铝盐、发酵粉、油漆、鞣料、澄清剂、媒染剂、造纸、防水剂等。
明矾净水是过去民间经常采用的方法，它的原理是明矾在水中可以电离出两种金属离子：KAl(SO4)2=K++Al3++2SO42-，而Al3+很容易水解，生成胶状的氢氧化铝Al(OH)3：Al3++3H2O=Al(OH)3（胶体）+3H+，氢氧化铝胶体的吸附能力很强，可以吸附水里悬浮的杂质，并形成沉淀，使水澄清。所以，明矾是一种较好的净水剂。
二、实验目的
（1）学会利用身边易得的废铝材料制备明矾的方法；
（2）巩固溶解度概念及其应用；认识铝和氢氧化铝的两性性质；
（3）练习和掌握溶解、过滤、结晶以及沉淀的转移和洗涤等无机制备中常用的基本操作和测量产品熔点的方法。
（4）学习从溶液中培养晶体的原理和方法。
三、实验原理
1、明矾的制备
将废铝样品溶解于稀氢氧化钾溶液中，值得偏铝酸钾：
2Al2KOH2H2O2KAlO23H2
在偏铝酸钾溶液中加入过量的浓硫酸，使其生成溶解度较小的复盐明矾（KAl(SO4)212H2O）反应式为：
在不同温度下明矾、硫酸铝、硫酸钾的溶解度（单位：g/100gH2O）如下表所示：
表1.1明矾、硫酸钾、硫酸铝在不同温度下的溶解度
温度（K）273
硫酸钾283XXXX33133XXXX3633.003.955.908.3911.724.871.010931.233.536.440.445.859.273.080.87.49.311.113.014.818.221.422.9
2、单晶的培养
要使晶体从溶液中析出，从原理上有两种方法。溶解度曲线下方为不饱和区域，若从处于不饱和区域的状态出发，要使晶体析出，一种方法是保持浓度一定，降低温度；另一方法是保持温度一定，增加浓度。
3、制备工艺流程
明矾制备流程图
四、仪器和试剂
（1）仪器：电子天平、烘箱、布氏漏斗、抽滤瓶、分光光度计、滴定管、容量瓶。
（2）试剂：氢氧化钾（1.5mol/L）、硫酸（f）、氨水（1+1）、盐酸（1+1）、EDTA（0.02205mol/L）、ZnAc2（0.01974mol/L）、二甲酚橙指示剂、20%六次甲基四胺。
五、实验步骤及数据处理
5.1明矾的制备
首先清除废铝表层的污染物，洗净，干燥，称重。用1.5mol/L的KOH溶液约50mL溶解2.0842g的废铝，抽滤，按化学计量关系滴加的3mol/L硫酸，适当加热至沉淀溶解，浓缩，冷却结晶，抽滤，得到明矾晶体25.2280g。
25.2280
产品回收率为
272.%68.95%474
5.2产品定量鉴定
5.2.1铝离子的定量检测
称取1.0182产品，溶解，用蒸馏水定容至250mL，摇匀。取三个洁净的锥形瓶，分别移取上述产品溶液20mL，0.02205molL-1EDTA溶液15mL及2滴二甲酚橙指示剂，小心滴加(1+1)NH3H2O调至溶液恰呈紫红色，然后滴加2滴(1+1)HCl。将溶液煮沸1min，冷却，加入20mL20％六次甲基四胺溶液，此时溶液应呈黄色，用醋酸锌标准溶液（0.01974molL-1）滴定至溶液由黄色恰变为紫红色即为终点。根据醋酸锌标准溶液所消耗的体积，计算明矾中Al3+的百分含量。
表1.2产品中Al的定量检测
试剂1号样2号样3号样
151515EDTA（ml）
8.508.358.35醋酸锌（ml）
由于Al3+和Zn2+同EDTA的络合反应，计量系数比均为1∶1，由此可用公式如下公式计算产品中Al3+含量：
Al%cVEDTAcVZn2
根据上述公式计算产品中铝离子含量为：表1.3产品中Al3+的质量百分比
MAl1.%20
23平均值理论值
5.696
铝的质量百分比（%）5.4015.4505.4505.434
5.2.2硫酸根离子的定量检测
采用比浊法测定硫酸根离子的含量，首先，称取0.091g硫酸钾固体，配置成100mL浓度为500μg/mL的标准硫酸钾溶液。称取1.018gKAl（SO4）12H2O晶体配置成250mL2
的样品溶液。分别量取0、1.0、2.0、3.0、4.0mLK2SO4标准溶液以及0.5、1.0mL产品溶液移入10mL的比色管中，然后分别加入5ml浓度为1g/mL的BaCl2溶液，用蒸馏水定容。用分光光度计测量标准系列以及样品的吸光度（波长采用420nm）。表1.3产品中硫酸根离子的定量检测吸光度A
硫酸钡悬浊液的吸光光谱图绘制如下：
硫酸钡悬浊液的吸光光谱图
实验二酪氨酸酶的提取及催化活性的研究
一、前言
酪氨酸酶（tyrosinase）又称多酚氧化酶，广泛存在于人、动物、植物和微生物中。当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时，在空气作用下，很快变为棕色，这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生如下反应，生成黑色素。它还能催化体内的酪氨酸羟化为多巴，进而氧化为多巴醌，最后聚合成黑色素分子，是体内黑色素形成的主要催化剂。缺乏此酶将导致代谢性病变：白化病；相反，如果该酶活力过高，又可形成黑色素瘤，最近人们还研究发现酪氨酸酶可能还与白癜风发病机制有关。因此研究酪氨酸酶不仅有理论意义，而且还有一定的应用价值。
酶参与的多巴转换反应
二、实验目的
认识生物体中酶的存在和催化作用，了解从土豆中提取酶的方法和研究酶活性的一般方法，学会用现代分析手段研究催化反应，特别是生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。
三、实验原理
许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在。生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。
通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。
由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。
酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH值、离子强度、温度等），25℃时在1min内转化1mol底物所需要催化剂的量为活性单位。通过下式可计算酶a
的活性：A106ktV，式中，a为所用溶液的酶的活性，A为最大吸收波长吸光度的变化，t为时间（min），k为多巴红的摩尔吸收系数，V为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：AaVo/m。式中A为原料中酶的活性（注意此处A不是吸光度A），V0为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。
四、主要仪器设备和试剂
榨汁机、离心机、分光光度计、调温水浴锅、秒表
磷酸二氢钾、氢氧化钠、酪氨酸、EDTA
五、实验步骤及数据处理
5.1酪氨酸酶的分离纯化
称取10g新鲜的去皮土豆，放入榨汁机中，将获得的土豆汁液转入带有刻度的离心管中，用Ph=7.2的缓冲溶液定容10mL，放入离心机中在2000~3000r/min转速下离心10min.取上清液。
5.2酪氨酸酶性质的探究5.2.1最大吸收波长的确定
移取0.4mL提取液加入2mL酪氨酸，用氢氧化钠溶液调为中性，用pH=6.0的缓冲溶液定容到10mL并摇匀，用分光光度计每隔10个波长测定一次吸光度A，根据A—λ作图确定最大吸收波长。实验数据如下表所示：
波长Abs
2600.145
2900.236
2700.071
2910.236
2800.092
2920.233
2850.125
2950.216
2860.163
3000.187
2880.22
3100.157
20.231
波长Abs
由此得吸收值最大的波长λ=291nm。
5.2.2反应时间实验
移取0.4mL提取液加入2mL酪氨酸，用氢氧化钠溶液调为中性，用pH=6.0的缓冲溶液定容到10mL并摇匀，在波长等于320nm条件下每隔一段时间记录一次吸收值，实验结果如下：
t（min）Abs
123XXXX10
0.1910.1560.0960.1120.1720.1850.1620.1450.2030.205
0.2030.2050.1760.1690.1580.1630.1510.1690.1
t（min）Abs
5.2.3抑制剂的影响
取五只比色管，分别依次加入2mL酪氨酸，用氢氧化钠溶液调为中性，再分别加入0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mLEDTA，然后用pH=6.0的缓冲溶液定容到10mL并摇匀，最后放在波长等于320nm条件下测定吸收值。
EDTA/mL0.0
Abs0.10.20.30.0670.0480.0440.04
从V—A的关系趋势中可以推断出：当抑制剂的浓度越大时，酪氨酸酶的活性越低。
5.2.4温度条件实验
取四只比色管，分别移取0.4mL土豆汁提取液，加入2mL酪氨酸，用氢氧化钠溶液调为中性，用pH=6.0的缓冲溶液定容到10mL并摇匀，然后分别放在温度等于25、40、50、60℃水浴中反应10min钟，然后放在波长等于320nm条件下测定吸收值，实验结果如下：
温度Abs
405060
0.0110.0220.014
根据曲线图土豆中提取的酪氨酸酶最适温度大约在35℃。
5.2.5酸度条件实验
取四只比色管按下列条件配置溶液，并定容至10mL，在波长等于320nm条件下测定吸收值。
土豆中提取的酪氨酸酶在中性环境下催化效率最高
5.2.6酶用量实验
取四只比色管，分别加入2mL酪氨酸，用氢氧化钠溶液调为中性，依次加入0.2.，0.4，0.6，0.8mL酪氨酸酶提取液，用pH=6.0的缓冲溶液定容到10mL并摇匀，在波长等于320nm条件下测定吸收值，实验结果如下：
0.021
0.04
0.048
0.054
5.2.7酪氨酸用量实验
取四只比色管，分别加入1.0，2.0，3.0，4.0mL酪氨酸，分别用氢氧化钠溶液调成中性，然后依次加入0.4mL酪氨酸提取液，再分别用pH=6.0的缓冲溶液定容到10mL并摇匀，在波长等于320nm条件下测定吸收值，实验结果如下：
V（底物）/mL
10.048
1.50.117
20.118
2.50.1
30.166
5.3实验结果讨论
综合前面的实验可以看出土豆中提取的酪氨酸酶的催化活性受到很多因素的影响。有最适合的酸度，在接近中性的溶液环境中催化活性最高；有最合适的温度，大约在35℃时具有较大的催化活性；另外抑制剂、反应时间、酶浓度和底物浓度都会影响到催化效率。
酶的活性可以根据下列动力学公式计算，一般定义在优化的条件下（pH、离子强度），25℃时在1min内转化1μmol底物所需要的量为酶的活性单位。
α=_106
式中：α为所用溶液的酶的活性，ΔA为最大吸收处吸光度的变化，t为时间，κ为多巴红的摩尔吸收系数，V为加入的酶体积。
由上式进而可以计算出所用原料中的酶的活性：
式中：A为原料中酶的活性，Vo为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。
六、思考题
1.影响酶活性的因素有哪些
答：影响酶活性的因素主要有温度、酸碱度以及抑制剂等。
2.提取物在放置过程中为何会变黑
答：因为提取物在放置过程中与空气接触，在氧存在的条件下提取物中发生多巴转换反应生成了黑色素。
3.热处理后酶的活性为何会显著降低
答：因为酶是一种蛋白质，热处理后结构被破坏，导致酶变性失活，是一种不可逆的反应，因此活性显著降低。
